L'area su cui sorge Rio de Janeiro venne raggiunta da esploratori portoghesi nel corso di una spedizione guidata dall'italiano Amerigo Vespucci, nel gennaio del 1501. Poiché gli europei inizialmente pensarono che la Baia di Guanabara fosse in realtà la foce di un fiume, e la chiamarono appunto "Rio de Janeiro".

La città venne fondata il 1 marzo 1565 dal cavaliere portoghese Estácio de Sá, che la chiamò São Sebastião do Rio de Janeiro, in onore del Re Sebastiano I del Portogallo. Per secoli l'insediamento fu comunemente chiamato São Sebastião, invece che con l'attualmente più popolare seconda parte del nome. Veniva spesso attaccata dai pirati, in particolare da quelli nemici del Portogallo, come olandesi e francesi. Alla fine del XVI secolo, la corona portoghese iniziò a considerare il villaggio come un luogo strategico per il transito atlantico delle navi che viaggiavano tra Brasile, colonie africane ed Europa. Vennero costruite delle fortezze e costituita un alleanza con le tribù native, per difendere l'insediamento dagli invasori - la vicina Niterói, ad esempio, venne fondata da un capo indigeno per aiutarne la difesa.

Il punto esatto dove venne fondata Rio si trova ai piedi del famoso monte Pan di zucchero (Pão-de-Açúcar). Più tardi, l'intera città venne spostata entro una palizzata in cima ad un colle, imitando la strategia medioevale europea di difesa dei castelli fortificati - il luogo venne da allora chiamato Morro do Castelo (Collina del Castello). Quindi la città si sviluppò dall'attuale centro in direzione sud e ovest, un movimento urbano riscontrabile ancor oggi.

Fino all'inizio del XVIII secolo, la città fu minacciata o invasa da diversi pirati e bucanieri, soprattutto francesi come Jean-François Duclerc, René Duguay-Trouin, e Nicolas de Villegaignon. Dopo il 1720, quando i portoghesi trovarono l'oro nel vicino capitanato di Minas Gerais, Rio de Janeiro divenne un utile porto per imbarcare le ricchezze, piuttosto del più distante Salvador. Nel 1763, l'amministrazione coloniale dell'America portoghese venne spostata a Rio.

La città rimase essenzialmente una capitale coloniale fino al 1808, quando la famiglia reale portoghese e gran parte dei nobili di Lisbona, fuggendo dall'invasione napoleonica del Portogallo, vi si trasferirono. La capitale del regno venne trasferita a Rio, che divenne quindi l'unica capitale europea al di fuori dell'Europa. Siccome non c'era spazio ne strutture urbane per accomodare centinaia di nobili, molti abitanti vennero semplicemente sfrattati dalle loro abitazioni.

Quando il principe Pedro dichiarò l'indipendenza del Brasile nel 1822, decise di tenere Rio de Janeiro come capitale del suo nuovo impero, eppure la regione della città stava perdendo importanza - economica e politica - nei confronti di San Paolo.